1. 簡介
Runx2(Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2早期稱為核心結(jié)合因子α-1(Cbfa1))是間充質(zhì)干細胞(MSCs)成骨細胞分化和骨形成的重要轉(zhuǎn)錄因子。在 Runx2 中具有純合突變的小鼠表現(xiàn)出胚胎牙齒發(fā)育停滯,由于缺乏成骨細胞分化而沒有膜內(nèi)和軟骨內(nèi)骨化,并且是胚胎致命的。Runx2 被體內(nèi)小鼠皮質(zhì)骨中的流體剪切應力激活,據(jù)報道拉伸和流體剪切應力等機械應力可增強成骨細胞中 Runx2 的表達并促進其在體外成骨細胞分化。這些發(fā)現(xiàn)表明,Runx2調(diào)節(jié)成骨細胞中的機械轉(zhuǎn)導以形成骨。然而,Runx2在機械應力誘導的骨形成中的生物學功能的潛在機制尚未闡明。
在本研究中,我們研究了Runx2在機械拉伸誘導骨重塑中的功能,通過在Runx2中對牙齒施加正畸力+/?小鼠,CCD的動物模型。我們研究了Runx2中的增殖和成骨細胞分化+/?實驗牙齒運動的張力側(cè)小鼠,以及源自Runx2的拉伸BMSC中的小鼠+/?小 鼠。最后,我們研究了mTORC2在Runx2中BMSC的機械拉伸誘導增殖和成骨細胞分化中的激活+/?小 鼠。
2. 材料和方法
2.7. 細胞培養(yǎng)
后,股骨和脛骨為6-9周齡野生型和Runx2+/?仔細清除小鼠貼壁軟組織中的細胞并收獲骨髓細胞。收集的細胞以4×10的密度接種7每3.5厘米組織培養(yǎng)的細胞并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng):Dulbecco的改良Eagle中低葡萄糖含有10%熱滅活胎牛血清和青霉素/鏈霉素,在 37 °C 的 5% CO 中2 大氣層。培養(yǎng)4天后,去除非貼壁細胞,再培養(yǎng)貼壁細胞3天,直到90%匯合,在本研究中用作BMSC。為了促進成骨,BMSCs在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng):補充有10nM地塞米松(Sigma),82μg/ ml l-抗壞血酸(Wako)和10mM β-甘油磷酸鹽(Sigma)的生長培養(yǎng)基,在37°C的5%CO2大氣層。每三天更換一次成骨培養(yǎng)基。
2.8. 機械拉伸在細胞上的應用
BMSCs在10厘米上播種在細胞拉伸腔室,涂有0.05mg / ml纖連蛋白(Sigma)并以12×1的密度培養(yǎng)10小時5細胞/厘米2.在細胞達到亞匯合后,使用專門設(shè)計的裝置拉伸它們,該裝置使腔室寬度單軸增加12%。拉伸值是根據(jù)拉伸誘導的BMSC增殖數(shù)據(jù)確定的。在使用抑制劑的情況下,在與抑制劑孵育1小時后拉伸細胞。未拉伸的細胞在相同條件下孵育并用作對照。
3. 結(jié)果
3.3. 拉伸對野生型和Runx2中BMSC增殖的影響+/?小 鼠
在牙齒運動的張力側(cè),PDL中招募的MSC在牙槽骨表面迅速增殖,并啟動成骨細胞的分化(Pavlin和Gluhak-Heinrich,2001)。 然后發(fā)生細胞外基質(zhì)的礦化并促進骨形成(Pavlin和Gluhak-Heinrich,2001)。闡明Runx2中牙齒運動張力側(cè)骨形成減少的機制+/?小鼠,我們拉伸小鼠BMSC并在體外檢查拉伸誘導的成骨細胞功能。我們檢查了野生型和Runx2中的DNA含量+/?拉伸后的BMSCs評估Runx2是否與成骨細胞譜系細胞的增殖有關(guān)。未拉伸(對照)野生型和Runx2中的DNA含量+/?BMSC增加并在機械負荷開始后48小時達到峰值(圖4A)。卸載野生型和Runx2之間的DNA含量沒有顯著差異+/?BMSC從0到48小時(圖4A)。在野生型BMSC中,機械刺激在拉伸12和24小時時顯著增加了DNA含量,在24小時達到峰值(圖4A)。同時,來自Runx2的DNA含量+/?BMSC在12和24小時拉伸顯著增加,并在36小時觀察到峰值(圖4A)。Runx2+/?與野生型BMSC相比,BMSC在24 h時表現(xiàn)出顯著降低拉伸誘導的DNA含量增加,而拉伸野生型和Runx2+/?BMSC在12、36和48小時沒有差異(圖4A)。此外,我們使用CCK-8進一步定量評估了BMSC的細胞增殖。在機械負荷開始2小時后,機械拉伸增加了野生型和Runx<>的增殖+/?BMSC,更重要的是拉伸的Runx2+/?與野生型BMSC相比,BMSC顯著增殖。
細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶(cdks)是驅(qū)動細胞周期的生長因子介導信號的整合因子(Baldin等人,1993;林和卡爾迪斯,2013 年)。生長因子促進細胞周期的G1期,D型細胞周期蛋白主要作為生長因子傳感器(Baldin等人,1993;林和卡爾迪斯,2013 年)。p21和p27是細胞周期蛋白D-cdk4復合物的緊密結(jié)合抑制劑并抑制G1進展(Harper等人,1993;波利亞克等人,1994年)。我們評估了細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在野生型和Runx2中的表達+/?在拉伸開始后6和12小時BMSC檢查細胞周期進程與拉伸的關(guān)聯(lián)。細胞周期蛋白D在未拉伸的野生型和Runx2中得到增強+/?BMSC在12小時與0小時相比(圖4B)。拉伸在野生型BMSC中6小時和Runx2中顯著誘導的周期蛋白D+/?12小時的BMSCs(圖4B)。 p21蛋白在未拉伸的野生型和Runx2中的表達+/?BMSCs從0到6小時沒有變化,但從6小時減少到12小時,盡管Runx2+/?無論機械負荷如何,BMSC在21至0 h期間的p12表達都明顯高于野生型BMSC(圖4B)。在野生型BMSC中,拉伸減弱p21在6小時時表達,但在12小時時不表達,而在Runx2+/?BMSC,在21和6小時拉伸減弱p12表達(圖4B)。從27到0小時,BMSCs中p12表達幾乎沒有差異,無論負載和Runx2基因劑量如何(圖4B)。
這些發(fā)現(xiàn)表明,拉伸增加了BMSC的增殖并調(diào)節(jié)了細胞周期進程,而Runx2基因劑量的減少延遲了機械刺激誘導的BMSCs增殖。
3.4. 拉伸對野生型和 Runx2 BMSC 成骨的影響+/?小 鼠
接下來,我們將拉伸加載到野生類型和 Runx2 上+/?成骨培養(yǎng)基中的BMSCs,研究Runx2對牽伸誘導的成骨細胞分化的影響。在未拉伸的野生型和 Runx2+/?BMSCs,ALP活性,一種早期成骨標志物,在拉伸開始后0至21天逐漸增加,此后下降,直到第28天,兩種基因型之間沒有顯著差異(圖4C)。在野生型BMSC中,拉伸在第7天和第14天顯著增加了ALP活性,并且在第7天ALP活性達到峰值(圖4C)。在 Runx2 中+/?BMSC,機械刺激在第14天顯著增強了ALP活性,但在第7天沒有,并且在第21天觀察到ALP活性的峰值。此外,雜合子Runx2缺乏癥在第14天顯著降低了BMSC中拉伸誘導的ALP活性(圖4C)。拉伸誘導的 Runx2 中 ALP 活性峰值+/?BMSC顯著低于野生型BMSCs(圖4C)。
機械負荷在拉伸開始后第14天顯著增加了野生型BMSC中的OSC mRNA表達,拉伸誘導的OSC mRNA表達在第21天達到峰值,此后下降(圖4D)。相反,拉伸顯著誘導了Runx2中的OSC mRNA表達+/?BMSC在第21天,但不在第14天(圖4D)。Runx2+/?BMSC的拉伸誘導OSC mRNA表達峰明顯低于野生型BMSCs(圖4D)。
我們進一步研究了拉伸誘導的基質(zhì)沉積鈣,這是成骨的晚期標志物,在野生型和Runx2的BMSC中+/?小鼠(圖4E)。在卸載的百搭型和 Runx2 中+/?BMSCs,鈣含量持續(xù)增加,直到拉伸開始后第28天,但野生型和Runx2之間沒有顯著差異+/? (圖4機械負荷在第21天和第28天以及Runx2中顯著提高了野生型BMSC的鈣含量。+/?BMSC在第28天,但不在第21天(圖4E)。第28天,Runx2中拉伸誘導的鈣含量+/?BMSC明顯低于野生型BMSC(圖4E)。
此外,野生型和Runx2+/?BMSC在機械刺激開始后第7天染色ALP,第21天染色茜素紅(圖4F和G)。拉伸導致兩種基因型的ALP和茜素紅色顯著染色(圖4F和G)。未拉伸和拉伸的 Runx2+/?BMSC的染色率低于相應的野生型BMSC(圖4F和G)。
綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)拉伸增強了野生型和Runx2的成骨作用。+/?BMSC,但 Runx2+/?與野生型BMSC相比,BMSCs顯示出拉伸誘導的成骨細胞分化減少和延遲。
3.5. 肺泡骨張力側(cè)成骨細胞中的 mTOR 和 Rictor 蛋白表達
評估m(xù)TORC2與Runx2中牙齒運動延遲張力側(cè)骨形成的相關(guān)性+/?小鼠,我們在實驗牙齒運動的張力側(cè)檢查了成骨細胞中mTOR和Rictor的蛋白質(zhì)表達。
在開始實驗牙齒移動之前(第0天),mTOR和Rictor在PDL中以野生型和Runx2表達+/?老鼠,雖然 Runx2+/?與野生型同窩小鼠相比,小鼠表現(xiàn)出兩種蛋白質(zhì)的表達較弱(圖5H,N,h和n,箭頭)。在實驗性牙齒運動的第1天和第3天,在野生型小鼠實驗牙齒運動的張力側(cè)檢測到成骨細胞中mTOR和Rictor表達增強(圖5J,P,L和R,箭頭),而Runx2+/?小鼠在第3天表現(xiàn)出這些蛋白質(zhì)的較弱表達(圖5j,p,l和r,箭頭)。在Runx2成骨細胞中未檢測到mTOR和Rictor的表達+/?第1天的小鼠(圖5i,j,o和p)。我們在牙齒運動開始后的第3天使用野生型小鼠作為陰性對照,并且沒有表達(數(shù)據(jù)未顯示)。
5. 結(jié)論
我們證明了Runx2中的牙齒移動延遲+/?小鼠與野生型小鼠的比較。這促使我們使用 Runx2+/?小鼠作為RUNX2CCD患者延遲正畸牙齒運動的模型+/?.此外,我們還展示了 Runx2+/?BMSCs減少拉伸誘導的增殖,并通過mTORC2激活分化為成骨細胞。我們的研究結(jié)果表明,Runx2與mTORC2 / Akt激活的關(guān)聯(lián)是牙齒運動過程中拉伸誘導的成骨細胞增殖和分化的關(guān)鍵作用之一。
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